PEWARNAAN GRAM

PEWARNAAN GRAM
Oleh: Matsrial Putra R
School of Medicine, Tadulako University


Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Infeksi ringan contohnya adalah faringitis, otitis, sinusitis, uretritis, dermatitis, impetigo, erysipelas, abscess, dll. Sedangkan infeksi berat contohnya adalah endocarditis, pneumonia, pleuritis, emfisema, encephalitis, ophtalmia neonatorum, osteomyelitis, meningitis, endometritis, salvingitis, demam reumatik, glomerulonephritis, sepsis, dll. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negatif adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll. Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negative. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sdangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas : 1. Gram A (violet) : a. Kristal violet b. Aalkohol c. Ammonium oksalat d. Aquades 2. Gram B (cokelat) a. Iodium b. Kalium iodide c. Aquades 3. Gram C
a. Aseton b. Alcohol 4. Gram D (merah) a. Safranin b. Alcohol c. Aquades Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan asam, conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis, Micobacterium leprae, Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C yang menyerang sistem imun, Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit, Nocardia, Legionella mycdatci, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia / Gordona, Cryptosporidium, Isospora, Cyclospora, Sarcocytis, dll. Contoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun adalah Nycordia, Rhodococcus, Tsukamurella, dan Gordonia. Hasil pewarnaan ZN akan mengidentifikasikan : 1. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Hasilnya berwarna merah. 2. Bakteri tidak tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh asam‐alkohol, jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid (50%‐nya tersusun atas asam mikolat). Asam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas 34‐90 karbon. Pewarnaan ZN terdiri dari : 1. ZN‐A (merah) Terdiri atas : a. Basic fusion b. Alcohol c. Fenol d. Aquades 2. ZN‐B (tidak berwarna) Terdiri atas : a. HCl b. Etil alcohol 3. ZN‐C (biru) Terdiri atas : a. Methylen blue b. Aquades


PERSIAPAN

Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal.
Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.

Alat dan bahan yang diperlukan adalah :
Alat :
 Ose atau kapas lidi steril
 Gelas obyek
 Lampu spiritus
Bahan :
 Bahan yang akan diperiksa.

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan.
a.1. Bahan langsung dari penderita
Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat.

a.2. Bahan dari biakan cair
Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.

a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat
Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita.

Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :
 Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
 Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)
 Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
 Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

a. Cat Gram
Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut :
1. Cat Gram A
Cat ini terdiri atas :
Kristal violet : 2 gram
Etil alkohol 95 : 20 ml
Ammonium oksalat : 0,8 gram
Akuades : 80 ml
Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.
2. Cat Gram B
Cat ini terdiri atas :
Yodium : 1 gram
Kalium Yodida : 2 gram
Akuades : 300 ml
Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
3. Cat Gram C
Cat ini terdiri atas :
Aseton : 50 ml
Etil alkohol 95 % : 50 ml
Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :
 Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif.
 Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.
4. Cat Gram D
Cat Gram D terdiri atas :
Safranin : 0,25 gram
Etil alkohol 95 % : 10 ml
Akuades : 90 ml
Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :
 Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.
 Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat Gram
Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu :
1. Teori Salton
Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.
Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.
2. Teori permeabilitas dinding sel
Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.
Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

CARA PENGECATAN GRAM
Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan.
Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu.
Alat dan bahan yang diperlukan adalah :
Alat :
 Rak pengecatan
 Kran/sumber air yang mengalir
Bahan :
 Cat Gram A, B, C dan D
 Preparat yang telah siap untuk dicat
Skema cara pengecatan Gram :













































KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM
Kelebihan :
1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.
2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.
Kekurangan :
Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Pustaka acuan :

Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Strohl, William A, Rouse,H, Fisher, BD, 2001, Lippincott’s Illustrated Reviews: Microbiology, Lippincott William & Wilkins, USA
fkuii.org/tiki-download_wiki_attachment.php?attId=211&page=mikrobiologi_lembar_kerja_praktikum